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    1. 新聞中心

        適用于多種樣品的高靈敏內毒素檢測方法

        為何要檢測內毒素 圖片

        為內毒素無處不在

        內毒素又稱為脂多糖(lipopolysaccharides,LPS,分子量范圍為3,000至4,000Da,由長鏈復合多糖尾部和疏水脂質基團組成(圖1)),是大多數格蘭氏陰性菌細胞壁的組成部分,具有較高的熱穩定性。當細菌在活躍生長或在死亡分解時,細胞壁中的脂多糖就被釋放到周圍環境中。

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        圖1.脂多糖結構。內毒素為復合脂多糖,是革蘭氏陰性細菌細胞壁的活性結構成分。它們由核心寡糖鏈、O-特異性多糖側鏈(O-抗原)和脂質組分(脂質A)組成。

        使用如大腸桿菌(E.coli)生產的重組蛋白,或者提取革蘭氏陰性菌內的核酸時經常遇到內毒素污染問題。內毒素污染的蛋白質/抗體/核酸在轉染入細胞中或者注入到動物體內時,可引發強烈的免疫反應,導致全身性炎癥反應綜合征(SIRS)和/或敗血癥。因此,內毒素的去除對于人類疾病治療的注射型藥品、生物制品等都是必須的,尤其對于基因藥物、蛋白藥物、抗體藥物、疫苗等生物制品的下游純化處理來說就顯得非常重要。

        中國藥典的規定

        細菌內毒素檢查法(通則 1143)包括兩種方法:凝膠法和光度測定法,后者又包括濁度法和顯色法,可以選用其中任何一種方法進行細菌內毒素檢查。凝膠法和光度法各具優點和局限:

        凝膠法

        凝膠法的優點是操作簡便,供試品在排除干擾作用后均可使用凝膠法進行檢驗。

        凝膠法的干擾試驗是確定供試品能否使用凝膠法的決定因素。進行干擾實驗時,應挑選與鱟試劑反應呈陰性的樣品進行干擾試驗。若樣品稀釋到 MVD(最大有效稀釋倍數) 仍不能排除干擾作用,應進一步對供試品的前處理進行研究,再用干擾試驗驗證能否使用凝膠法。

        光度法

        光度法(包括濁度法和顯色法)可定量檢測內毒素的含量,能較為準確評估產品在生產過程中污染的相對風險,定量檢測的數據不僅有利于追蹤產品質量趨勢,還能起到風險預警的作用,更易達到數據完整性的要求。

        由于光度法的檢測限范圍比凝膠法寬,使得有干擾的樣品可以有更大的稀釋倍數,對于部分使用凝膠法無法排除干擾的樣品,可以嘗試使用光度法建立細菌內毒素檢測方法。

        常用實驗方法和干擾分析

        鱟試劑是從海洋動物鱟提取的血細胞溶解物,是檢測革蘭氏陰性細菌內毒素的一種敏感試劑。其實驗原理如圖2所示:

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        圖2.鱟試劑的級聯反應。LPS(內毒素)激活質膜結合因子C?;罨囊蜃覥激活因子B,活化的因子B激活凝固酶原,生成凝血酶。加入顯色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA后,活化的蛋白酶-凝血酶催化對硝基苯胺(pNA)的釋放,產生黃色。通過測量405nm處吸光度值進行定量。根據標準曲線可推算得出結果。紅色表示無活性酶,綠色表示活性酶。

        通常實驗流程:

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        Thermo提供光度法內毒素定量試劑 (A39552)。那么試劑的品質如何?我們將從靈敏度、數據重復性、抗干擾性等幾個角度對Pierce內毒素定量試劑盒的性能進行驗證:

        數據靈敏度和重復性

        提供兩個線性動態范圍:0.01-0.1 EU/mL和0.1-1.0 EU/mL(圖3)。使用此試劑盒的實驗-實驗和操作者-操作者差異系數(CV)為3%。靈敏度高可以有效地避免內毒素定量中潛在的假陰性或者假陽性。

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        圖3.Pierce內毒素定量試劑盒的標準曲線。標準曲線顯示出優異的線性度,r2= 0.99。Pierce顯色法內毒素定量試劑盒的較低標準曲線范圍為0.01-0.1 EU/mL。0.1–1.0 EU/mL標準曲線表示使用內毒素標準品和阿米巴樣細胞裂解物培養14分鐘,隨后使用顯色底物培養6分鐘。對于較低濃度,使用內毒素標準品和阿米巴樣細胞裂解物培養30分鐘,隨后使用顯色底物培養6分鐘。低濃度標準品(0.01-0.1 EU/mL)顯示出了一致性和再現性(n = 17;CV = 3%)。

        兼容性

        鱟試劑可能受許多因素影響,造成假陰性或假陽性。包括:

        i. 反應溫度、樣品酸堿度、離子強度和金屬離子(如鎂和鈣)

        ii. 血清蛋白、核酸、脂肪酸、表面活性劑和螯合劑(如EDTA和肝素)可引起內毒素分子結構的變化

        iii. (1-3)-β-D-葡聚糖的非特異性干擾:鱟試劑會與其反應,造成假陽性結果

        表1.使用Pierce顯色法內毒素定量試劑盒,獲得有效內毒素檢測結果所兼容的最高濃度。所列出的濃度是指樣品中添加0.5 EU內毒素時,未使定量值降低的實際濃度。以比例的形式表示稀釋濃度,其中1:100表示100倍稀釋

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        需要指出的是:Pierce顯色法內毒素定量試劑盒(貨號A39552)與β-葡聚糖兼容,并且在含有10ng/ mL(1,3)-β-D-葡聚糖的樣品中,未顯示出增強作用。

        內毒素去除

        超濾、多粘菌素B親和樹脂以及基于樹脂或膜的色譜法是內毒素去除的傳統方法,這些方法在蛋白回收率、內毒素結合能力等方面具有一定的局限性,有的甚至本身具有毒。

        Thermo Fisher Scientific提供高載量內毒素去除樹脂(88270),是基于ε-聚賴氨酸親和樹脂(天然賴氨酸的無毒聚合物),顯示出內毒素結合能力和蛋白質回收率:

        ? 結合力可以達到2,000,000 EU/mL

        ? 在處理初始內毒素水平為10,000 EU/mL的樣品時,去除效率可以達到99%以上

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        圖4.采用Pierce高通量內毒素去除樹脂去除內毒素的效率。(A)內毒素去除和定量的工作流程。(B)測定和去除蛋白質樣品中的內毒素以備下游應用。


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